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高速近接場蛍光顕微鏡と高速原子間力顕微鏡の組み合わせによる生物学的研究
High-speed near-field fluorescence microscopy combined with high-speed atomic force microscopy for biological studies.
PMID: 30890438 DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.011.
抄録
背景:
高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)は、様々なタンパク質分子が機能的に活動している間の可視化に成功しています。しかし、タンパク質と相互作用する低分子や、タンパク質がカプセル化された状態のタンパク質分子を可視化することはできません。そのため、高い相関精度で高い時空間分解能で光学・AFM同時イメージングが可能な技術の実現が望まれていました。
BACKGROUND: High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) has successfully visualized a variety of protein molecules during their functional activity. However, it cannot visualize small molecules interacting with proteins and even protein molecules when they are encapsulated. Thus, it has been desired to achieve techniques enabling simultaneous optical/AFM imaging at high spatiotemporal resolution with high correlation accuracy.
方法:
走査型近接場光学顕微鏡(SNOM)は、HS-AFMとの組み合わせの候補である。しかし、走査型近接場光学顕微鏡(SNOM)のイメージング速度は、HS-AFMのイメージング速度をはるかに下回っていた。本研究では、先端スキャン型HS-AFMを利用して、金属チップを用いた全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を開発した。
METHODS: Scanning near-field optical microscopy (SNOM) is a candidate for the combination with HS-AFM. However, the imaging rate of SNOM has been far below that of HS-AFM. We here developed HS-SNOM and metal tip-enhanced total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) by exploiting tip-scan HS-AFM and exploring methods to fabricate a metallic tip on a tiny HS-AFM cantilever.
結果:
チップ強化型TIRFM/HS-AFMでは、比較的高濃度のバルク溶液中の蛍光分子の存在下で、2つのモダリティの画像を同時にビデオ記録することが実証された。また、作製した金属製の先端カンチレバーとSNOM光学系を備えた先端スキャン型HS-AFMセットアップを用いることで、2つの画像を重ね合わせたときの相関解析を容易にしながら、同時にHS-SNOM/HS-AFMイメージングを行うことができた。
RESULTS: In tip-enhanced TIRFM/HS-AFM, simultaneous video recording of the two modalities of images was demonstrated in the presence of fluorescent molecules in the bulk solution at relatively high concentration. By using fabricated metal-tip cantilevers together with our tip-scan HS-AFM setup equipped with SNOM optics, we could perform simultaneous HS-SNOM/HS-AFM imaging, with correlation analysis between the two overlaid images being facilitated.
結論:
本研究により、高い時空間分解能でのTIRFM/HS-AFMとHS-SNOM/HS-AFMの同時イメージングが可能となった。今後の課題もあるが、これらの相関顕微鏡法は、生物学研究における HS-AFM の汎用性を高める可能性を秘めている。
CONCLUSIONS: This study materialized simultaneous tip-enhanced TIRFM/HS-AFM and HS-SNOM/HS-AFM imaging at high spatiotemporal resolution. Although some issues remain to be solved in the future, these correlative microscopy methods have a potential to increase the versatility of HS-AFM in biological research.
一般的な意味:
我々は、典型的なSNOMイメージングの100倍以上のイメージングレートである3s/frameのイメージングレートを達成しました。また、溶液中で蛍光標識されたDNAのHS-SNOMイメージングでは、39nmの分解能を示した。
GENERAL SIGNIFICANCE: We achieved an imaging rate of ~3 s/frame for SNOM imaging, more than 100-times higher than the typical SNOM imaging rate. We also demonstrated ~39 nm resolution in HS-SNOM imaging of fluorescently labeled DNA in solution.
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