大腸菌表面に固定化されたGMPキナーゼとアセテートキナーゼによる(デオキシ)グアノシン-5'-三リン酸の生合成

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Enzyme Microb. Technol..2019 Mar;122:82-89. S0141-0229(18)30415-0. doi: 10.1016/j.enzmictec.2018.12.011.Epub 2018-12-27.

大腸菌表面に固定化されたGMPキナーゼとアセテートキナーゼによる(デオキシ)グアノシン-5'-三リン酸の生合成

Biosynthesis of (deoxy)guanosine-5'-triphosphate by GMP kinase and acetate kinase fixed on the surface of E. coli.

Yefeng Yao
Qingbao Ding
Ling Ou

PMID: 30638512 DOI: 10.1016/j.enzmictec.2018.12.011.

抄録

(デオキシ)グアノシン-5'-三リン酸(5'-(d)GTP)は、生体内でDNAやRNAを合成する前駆体であり、PCRをベースとした様々な現代バイオテクノロジーの重要な原料である。本研究では、(デオキシ)グアノシン-5'-一リン酸(5'-(d)GMP)からの5'-(d)GTPの生合成反応における、細菌の細胞表面表示により構築された全細胞触媒の応用を検討した。氷核生成タンパク質のN末端またはN-とC末端の融合により、Lactobacillus bulgaricusのGMPキナーゼと大腸菌のアセテートキナーゼを大腸菌細胞の表面に表示することに成功した。0.2mM IPTGを用いて25℃で30時間誘導すると、大量の可溶性標的タンパク質が得られた。また、表面表示酵素を用いて37℃で4時間培養したところ、dGMPの変換率は91%に達した。また、3時間の反応で最大95%のGMPが変換された。全細胞触媒の37℃での安定性は非常に良好であった。酵素活性は9回の回収後も50%以上を維持していた。我々の研究では、添加されたATPの初期基質濃度の20分の1の濃度でしか反応要件を満たすことができなかったが、本研究では、添加されたATPの初期基質濃度の20分の1の濃度でも反応要件を満たすことができた。

(Deoxy)guanosine-5'-triphosphate (5'-(d)GTP), the precursor for synthesizing DNA or RNA in vivo, is an important raw material for various modern biotechnologies based on PCR. In this study, we investigated the application of whole-cell catalysts constructed by bacterial cell surface display in biosynthetic reactions of 5'-(d)GTP from (deoxy)guanosine-5'-monophosphate (5'-(d)GMP). By N-terminal or N- and C-terminal fusion of the ice nucleation protein, we successfully displayed the GMP kinase of Lactobacillus bulgaricus and the acetate kinase of E. coli on the surface of E. coli cells. A large amount of soluble target protein was obtained upon induction with 0.2 mM IPTG at 25 °C for 30 h. The conversion of dGMP was up to 91% when catalysed by the surface-displayed enzymes at 37 °C for 4 h. Up to 95% of the GMP was converted after 3 h of reaction. The stability of the whole-cell catalyst at 37 °C was very good. The enzyme activity was maintained above 50% after 9 rounds of recovery. Our research showed that only one-twentieth of the initial substrate concentration of added ATP was sufficient to meet the reaction requirements.