タンパク質-ペプチド相互作用を利用した部位選択的リジン反応の研究

Site-Selective Lysine Reactions Guided by Protein-Peptide Interaction.

• Yu Zhang
• Yujie Liang
• Feng Huang
• Yue Zhang
• Xuechen Li
• Jiang Xia

抄録

アセチル化、メチル化、水酸化、イソペプチド形成などの部位選択的なリジン翻訳後修飾は、細胞内の重要なシグナル伝達イベントの正確な制御を紛れもない正確さで媒介しています。この比類のない部位選択性（プロテオーム中の特定のタンパク質中の単一リジンの修飾）は、非酵素的タンパク質反応の課題であり、リジンε-アミノ基を他の反応性基と区別することや、類似の化学反応性を持つ他の多くのリジンε-アミノ基やタンパク質のN末端アミンの中から特定のリジンε-アミノ基を正確にピンポイントで特定することが困難である。ここで、我々は、ペプチド誘導フルオロジニトロベンゼン、イソチオシアン酸、およびフェニルエステル反応を介して近位リジン共役反応を探索し、複数のリジン残基を含む天然タンパク質中の1つの単一のリジンのε-アミノ基の部位特異的なターゲティングを検証した。この正確な部位選択性は、特定のタンパク質-ペプチド相互作用によって誘導された近接誘導反応性の結果です。結合ガイドリジン反応は、最初にSH3ドメイン上で試験され、次に、SUMO、Atg8タンパク質ファミリー、植物ATG8、および表面に少なくとも7個のリジン残基を含む哺乳類LC3タンパク質のようないくつかのユビキチン様タンパク質上で試験された。絶妙な部位選択性が、試験したすべてのタンパク質において確認された。一連のアミン反応について、部位選択的リジン反応の実現可能性を試験した。選択されたアミン反応性基は最適化され、LC3タンパク質上の反応部位は質量分析によって確認された。

Site-selective lysine post-translational modifications such as acetylation, methylation, hydroxylation, and isopeptide formation mediate the precise control of important signaling events in cells with unmistakable accuracy. This unparalleled site selectivity (modification of a single lysine in a particular protein in the proteome) is still a challenge for non-enzymatic protein reactions; the difficulty lies in the differentiation of the lysine ε-amino group from other reactive groups and in the precise pinpointing of one particular lysine ε-amino group out of many other lysine ε-amino groups and the N-terminal amine of the protein that have similar chemical reactivity. Here, we have explored proximal lysine conjugation reactions through peptide-guided fluorodinitrobenzene, isothiocyanate, and phenyl ester reactions and have validated the site-specific targeting of the ε-amino group of one single lysine in natural proteins that contain multiple lysine residues. This precise site selectivity is a result of the proximity-induced reactivity guided by a specific protein-peptide interaction: the binding interaction preorganizes an amine-reactive group in the peptide and one of the lysine side chain ε-amino groups of the protein into close proximity, thereby confining the reactivity to a selected area of the target protein. The binding-guide lysine reactions were first examined on an SH3 domain and then tested on several ubiquitin-like proteins such as SUMO, Atg8 protein family, plant ATG8, and mammalian LC3 proteins that contain at least seven lysine residues on the surface. Exquisite site selectivity was confirmed in all of the proteins tested. A set of amine reactions were tested for their feasibility in the site-selective lysine reaction. Selected amine-reactive groups were optimized, and the reaction sites on the LC3 protein were confirmed by mass spectrometry.