難解な細菌からDNAを最大限に放出するための新しい化学的溶解法です

A novel chemical lysis method for maximum release of DNA from difficult-to-lyse bacteria.

• Olle M de Bruin
• Amy Chiefari
• Danielle Wroblewski
• Christina Egan
• Cassandra D Kelly-Cirino

抄録

微生物の分子検出には、細胞からDNAを放出する必要がある。しかし、微生物の中には化学的方法や酵素的方法では溶解が困難なものもあるため、溶解が困難な微生物を破壊するためには、ビーズ叩きによる機械的溶解が一般的に行われています。sporeLYSEと呼ばれる新たに開発された化学的溶解法は、ビーズ叩きを行わずに難溶性微生物からDNAを放出することを可能にした。sporeLYSE法は、カテゴリーAのバイオテロリストのサロゲートを含むin vitroで増殖した微生物からDNAを放出するために、ビーズ叩打法とアルカリ性/洗浄剤を用いた溶解法とを比較した。sporeLYSE は、Mycobacterium smegmatis、Francisella philomiragia、Yersinia enterocolitica、Bacillus thuringiensis、緑膿菌、Moraxella catarrhalis および Klebsiella pneumoniae から 83%～100% の DNA を放出しました。qPCR の結果、sporeLYSE は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌からビーズ叩打法またはアルカリ性/洗剤溶解法のいずれかと同等またはそれ以上の量の DNA を抽出することが示されました。M. smegmatisとM. tuberculosisの唾液と喀痰からそれぞれsporeLYSEを用いてDNAを抽出した場合、qPCRのCt値はアルカリ/洗剤溶解や加熱による抽出に比べて4～8サイクル低かった。Clostridium difficileおよびC. botulinumの胞子からのsporesLYSE抽出の平均Ct値は、MagNA Pure DNA抽出の平均Ct値よりも約2サイクル低かった。この結果から、sporeLYSEは、胞子を含む様々な細菌から大量のDNAを効率的に放出できる使いやすい液体試薬であることが示唆されました。

Molecular detection of microorganisms requires releasing DNA from cells. However, since certain microbial organisms are refractory to lysis by chemical or enzymatic methods, mechanical lysis by bead-beating is typically employed to disrupt difficult-to-lyse microbes. A newly developed chemical lysis method called sporeLYSE enables release of DNA from difficult-to-lyse microbes without bead-beating. The sporeLYSE method was compared to bead-beating and an alkaline/detergent lysis solution for releasing DNA from microbes grown in vitro, including surrogates of Category A bioterrorism agents. sporeLYSE released 83% to 100% of DNA from Mycobacterium smegmatis, Francisella philomiragia, Yersinia enterocolitica, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis and Klebsiella pneumoniae. qPCR results indicated that sporeLYSE extracted an equal or greater amount of DNA than either bead-beating or alkaline/detergent lysis from Gram-positive and Gram-negative bacteria. When sporeLYSE was used to extract DNA from saliva and sputum spiked with M. smegmatis and M. tuberculosis, respectively, the qPCR Ct values were 4-8 cycles lower than those for extractions via alkaline/detergent lysis and heat. Mean Ct values for sporesLYSE extractions from spores of Clostridium difficile and C. botulinum were approximately two cycles lower than those of MagNA Pure DNA extractions. Our results suggest that sporeLYSE is an easy-to-use liquid reagent that can efficiently release large amounts of DNA from a variety of bacteria, including spores.

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