ヒトコレクチン-11（CL-11、CL-K1）の特性評価のための定量的アッセイの開発

Development of a Quantitative Assay for the Characterization of Human Collectin-11 (CL-11, CL-K1).

• Rafael Bayarri-Olmos
• Nikolaj Kirketerp-Moller
• Laura Pérez-Alós
• Karsten Skjodt
• Mikkel-Ole Skjoedt
• Peter Garred

抄録

コレクチン-11（CL-11）は、補体のレクチン経路のパターン認識分子であり、宿主防御から胚発生に至るまで多様な機能を持っています。CL-11は、相同性の高いコレクチン-10（CL-10）とヘテロコンプレックスを形成して循環中に存在しています。CL-11の血漿中濃度異常は、播種性血管内凝固、尿路片麻疹、先天性疾患と関連している。CL-11の特徴付けには目覚しい発展が見られたが、その解析のための臨床ツールはまだ不足している。そこで、我々はモノクローナル抗体を作製し、循環中のCL-11を定量的に測定するELISAを開発した。この抗体は組換えCL-11に対してスクリーニングされ、ELISA法および血清および血漿の免疫沈降法によって検証された。最良の候補をペアワイズで比較し、定量的 ELISA を開発しました。その結果，感度，再現性，希釈直線性が確認され，0.29～18.75 ng/ml の範囲で十分な変動が認められた．健康なコントロールにおける CL-11 の平均血漿中濃度は 289.4 ng/ml（範囲 143.2～459.4 ng/ml）であり、CL/10/11 複合体のレベルと高い相関性を示した（= 0.729）。血漿中のCL-11とCL-10/11は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、〜400および>600 kDaの2つの主要な複合体として共存していた。さらに、全身性炎症反応症候群で集中治療室に入院した患者では、入院時にCL-11の血漿中濃度が有意に低下することが確認されました。また、CL-11はカルシウムとは独立してジモサンに結合することが明らかになりました。最後に、CL-11/MASP-2 複合体がザイモサン上に C4b を沈着させることを示した。結論として、我々は、健康と疾患における CL-11 の拡大し続ける役割を調べるために、特異的かつ感度の高い ELISA を開発し、CL-11 とザイモサンとの間の新たな相互作用を示した。

Collectin-11 (CL-11) is a pattern recognition molecule of the lectin pathway of complement with diverse functions spanning from host defense to embryonic development. CL-11 is found in the circulation in heterocomplexes with the homologous collectin-10 (CL-10). Abnormal CL-11 plasma levels are associated with the presence of disseminated intravascular coagulation, urinary schistosomiasis, and congenital disorders. Although there has been a marked development in the characterization of CL-11 there is still a scarcity of clinical tools for its analysis. Thus, we generated monoclonal antibodies and developed a quantitative ELISA to measure CL-11 in the circulation. The antibodies were screened against recombinant CL-11 and validated by ELISA and immunoprecipitation of serum and plasma. The best candidates were pairwise compared to develop a quantitative ELISA. The assay was validated regarding its sensitivity, reproducibility, and dilution linearity, demonstrating a satisfactory variability over a working range of 0.29-18.75 ng/ml. The mean plasma concentration of CL-11 in healthy controls was determined to be 289.4 ng/ml (range 143.2-459.4 ng/ml), highly correlated to the levels of CL/10/11 complexes ( = 0.729). Plasma CL-11 and CL-10/11 co-migrated in size exclusion chromatography as two major complexes of ~400 and >600 kDa. Furthermore, we observed a significant decrease at admission in CL-11 plasma levels in patients admitted to intensive care with systemic inflammatory response syndrome. By using the in-house antibodies and recombinant CL-11, we found that CL-11 can bind to zymosan independently of calcium by a separate site from the carbohydrate-binding region. Finally, we showed that CL-11/MASP-2 complexes trigger C4b deposition on zymosan. In conclusion, we have developed a specific and sensitive ELISA to investigate the ever-expanding roles of CL-11 in health and disease and shown a novel interaction between CL-11 and zymosan.