サッカロミセス・セレビシエの代謝工学による高力価グルカル酸の効率的生産の実現

Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient production of glucaric acid at high titer.

• Na Chen
• Jingya Wang
• Yunying Zhao
• Yu Deng

抄録

背景:

グルカル酸は、様々な分野で利用できる高付加価値の化学物質である。グルコースを化学的に酸化してグルカル酸を生産することは環境に優しくないため、近年、微生物による生産が注目されています。大腸菌およびサッカロミセス・セレビシエにおいて、ミオ-イノシトール-1-リン酸合成酵素（Ino1）、ミオ-イノシトールオキシゲナーゼ（MIOX）、ウロン酸脱水素酵素（Udh）をコードする遺伝子を共発現させることにより、グルコースからグルカル酸を合成する生物学的経路が構築されてきた。しかし、MIOXの活性が低く不安定であることが、この経路のボトルネックとなっていることが判明した。

BACKGROUND: Glucaric acid is a high-value-added chemical that can be used in various fields. Because chemical oxidation of glucose to produce glucaric acid is not environmentally friendly, microbial production has attracted increasing interest recently. Biological pathways to synthesize glucaric acid from glucose in both Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae by co-expression of genes encoding myo-inositol-1-phosphate synthase (Ino1), myo-inositol oxygenase (MIOX), and uronate dehydrogenase (Udh) have been constructed. However, low activity and instability of MIOX from Mus musculus was proved to be the bottleneck in this pathway.

結果:

本研究では、より安定なシロイヌナズナ由来のmiox4を選択した。さらに、miox4 の発現量をさらに増加させるために、S. cerevisiae ゲノムへの高コピーデルタ配列統合を行った。酵素アッセイと定量的リアルタイムPCR解析の結果、デルタ配列に基づく統合発現はMIOX4の活性と安定性を向上させ、エピソーム発現に比べてグルカル酸価を約8倍に増加させることが明らかになった。また、60mM（10.8g/L）のイノシトールを添加してバッチ発酵させることで、ミオイノシトールから6g/L（28.6mM）のグルカル酸を産生した。

RESULTS: A more stable miox4 from Arabidopsis thaliana was chosen in the present study. In addition, high copy delta-sequence integration of miox4 into the S. cerevisiae genome was performed to increase its expression level further. Enzymatic assay and quantitative real-time PCR analysis revealed that delta-sequence-based integrative expression increased MIOX4 activity and stability, thus increasing glucaric acid titer about eight times over that of episomal expression. By fed-batch fermentation supplemented with 60 mM (10.8 g/L) inositol, the multi-copy integrative expression S. cerevisiae strain produced 6 g/L (28.6 mM) glucaric acid from myo-inositol, the highest titer that had been ever reported in S. cerevisiae.

結論:

本研究では、A. thaliana由来のmiox4遺伝子とPseudomonas syringae由来のudh遺伝子をゲノムのデルタ配列に統合することで、S. cerevisiaeのグルカル酸価を6g/Lまで上昇させた。デルタ配列に基づく統合発現は、標的遺伝子のコピー数とその安定性の両方を増加させることができた。このアプローチは、S. cerevisiaeを用いた幅広い代謝経路工学への応用が期待される。

CONCLUSIONS: In this study, glucaric acid titer was increased to 6 g/L in S. cerevisiae by integrating the miox4 gene from A. thaliana and the udh gene from Pseudomonas syringae into the delta sequence of genomes. Delta-sequence-based integrative expression increased both the number of target gene copies and their stabilities. This approach could be used for a wide range of metabolic pathway engineering applications with S. cerevisiae.