柑橘類黄色モザイクウイルスの迅速、高感度でロバストなインデックス化のための等温ベースのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイ

An isothermal based recombinase polymerase amplification assay for rapid, sensitive and robust indexing of citrus yellow mosaic virus.

• P V Kumar
• S K Sharma
• N Rishi
• D K Ghosh
• V K Baranwal

抄録

ウイルス性疾患の管理は、明確で感度の高い検出方法に依存しています。バドナウイルス属の二本鎖DNAウイルスであるシトラスイエローモザイクウイルス（CYMV）は、柑橘類の植物に黄色のモザイク病を引き起こす。CYMVは芽木を介して感染するため、芽木認証プログラムのための堅牢で簡易なインデックスプロトコルが必要である。本研究では、CYMVの検出と診断のための感度が高く、迅速で、簡単で、費用対効果の高い方法として、等温ベースのリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）アッセイの開発と標準化について報告する。CYMVのORF III（ポリタンパク質をコードする）領域とORF II（ウイルス関連タンパク質をコードする）領域から2つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーセットを設計し、増幅アッセイを行った。精製されたDNAと植物の粗樹液を用いて，RPA，PCRおよびイムノキャプチャーリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（IC-RPA）をベースとしたアッセイの比較評価を行った。RPAおよびIC-RPAアッセイでは、CYMV感染が生樹液から効率的に検出された。RPAで使用したプライマーセットは特異的であり、別のバドナウイルス種であるバナナストリークMYウイルス（BSMYV）との交差増幅を示さなかった。本研究の結果は、RPAアッセイが柑橘類の植え付け材料の日常的な索引付けに容易に使用できることを示した。我々の知る限りでは、本研究はCYMVの迅速かつ簡便な等温検出法を開発した最初の報告であり、検疫や芽材認証プロセスにおいて有効な技術として活用できるものと考えられる。

Management of viral diseases relies on definite and sensitive detection methods. Citrus yellow mosaic virus (CYMV), a double stranded DNA virus of the genus Badnavirus, causes yellow mosaic disease in citrus plants. CYMV is transmitted through budwood and requires a robust and simplified indexing protocol for budwood certification programme. The present study reports development and standardization of an isothermal based recombinase polymerase amplification (RPA) assay for a sensitive, rapid, easy, and cost-effective method for detection and diagnosis of CYMV. Two different oligonucleotide primer sets were designed from ORF III (coding for polyprotein) and ORF II (coding for virion associated protein) regions of CYMV to perform amplification assays. Comparative evaluation of RPA, PCR and immuno-capture recombinase polymerase amplification (IC-RPA) based assays were done using purified DNA and plant crude sap. CYMV infection was efficiently detected from the crude sap in RPA and IC-RPA assays. The primer set used in RPA was specific and did not show any cross-amplification with banana streak MY virus (BSMYV), another Badnavirus species. The results from the present study indicated that RPA assay can be used easily in routine indexing of citrus planting material. To the best of our knowledge, this is the first report on development of a rapid and simplified isothermal detection assay for CYMV and can be utilized as an effective technique in quarantine and budwood certification process.