分裂酵母における全RNAの単離と特異的RNAの定量

Total RNA Isolation and Quantification of Specific RNAs in Fission Yeast.

• Robert Roth
• Hiten D Madhani
• Jennifer F Garcia

抄録

分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombeは、遺伝子制御を研究するための重要なモデル生物である。このような研究には、特定のRNAのレベルを定量する能力が不可欠である。我々は、逆転写と定量PCRを用いたS. pombeのRNAの単離と定量のためのプロトコルを記述します。この手順では、細胞をジルコニアビーズを使用して溶解し、その後、Trizol試薬を使用してタンパク質やDNAから選択的に離れて総RNAを分離します。汚染DNAは、その後、TURBO DNaseを使用してRNAから除去され、簡単に不活性化され、その後のクリーンアップステップを必要としません。RNAは、その後、ランダム9マーズとオリゴdTプライマーを使用してcDNAに逆転写されます。その後、SYBR greenを用いた定量PCRを行い、RNAレベルを定量します。このプロトコルは、いくつかのS. pombe遺伝子型でテストされており、再現性の高い結果が得られています。

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is an important model organism for investigations of gene regulation. Essential to such studies is the ability to quantify the levels of a specific RNA. We describe a protocol for the isolation and quantification of RNA in S. pombe using reverse-transcription followed by quantitative PCR. In this procedure, the cells are lysed using zirconia beads, then total RNA is selectively isolated away from proteins and DNA using the Trizol reagent. Contaminating DNA is then removed from the RNA by using TURBO DNase, which is easily inactivated and requires no subsequent clean-up step. The RNA is then reverse transcribed into cDNA using random nine-mers and oligo dT primers . Quantitative PCR using SYBR green is then performed to quantify RNA levels. This protocol has been tested on several S. pombe genotypes and generates highly reproducible results.