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Lasers Med Sci.2018 Jan;33(1):95-102.

低レベルレーザー照射によるヒト剥離乳歯由来幹細胞のin vitro増殖の誘導

Low-level laser irradiation induces in vitro proliferation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth.

PMID: 29027031

抄録

本研究の目的は、低レベルレーザー照射(LLLI)がヒト剥離乳歯(SHED)由来の幹細胞の増殖および生存率に及ぼす影響を評価することである。InGaAlPレーザーダイオード(660nm、30mW、連続動作モード)を用いて、2種類のエネルギー密度(0.5J/cm-16s;1.0J/cm-33s)で細胞を照射するかしないか(コントロール)した。照射は0時間後と48時間後に行い、レーザープローブは細胞から0.5cmの距離に固定した。細胞増殖は0、24、48、72hにトリパンブルー排除法およびMTTアッセイで解析した。細胞周期とKi67の発現はフローサイトメトリーで解析した。アポトーシスに関連する事象は、アネキシンV/PIの発現とDAPIによる染色による核の形態変化により評価した。各時刻における群間差は、Kruskal-Wallis検定およびMann-Whitney検定により、有意水準5%(p<0.05)を採用して解析した。その結果、エネルギー密度1.0J/cmは、コントロール群および0.5J/cm群と比較して、48時間および72時間における細胞増殖の増加を促進することが明らかとなった。細胞周期解析の結果、照射群ではS期およびG2/M期の細胞が優勢であった。この所見は、Ki67の発現の増加によって確認された。アネキシンVとPIの低陽性染色は全群で観察され、核の変化は検出されなかったことから、細胞生存率は試験したエネルギー密度の影響を受けていないことが示された。使用したLLLIパラメータ(660nm、30mW、1.0J/cm)は、SHEDの増殖と細胞生存率の維持を促進すると結論づけることができる。

The aim of this study was to evaluate the effect of low-level laser irradiation (LLLI) on the proliferation and viability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED). Cells were irradiated or not (control) with an InGaAlP laser diode (660 nm, 30 mW, continuous action mode) using two different energy densities (0.5 J/cm-16 s; 1.0 J/cm-33 s). Irradiation was performed at 0 and 48 h, with the laser probe fixed at a distance of 0.5 cm from the cells. Cell proliferation was analyzed at 0, 24, 48, and 72 h by the Trypan blue exclusion method and MTT assay. Cell cycle and Ki67 expression were analyzed by flow cytometry. Apoptosis-related events were evaluated by expression of annexin V/PI and nuclear morphological changes by staining with DAPI. Differences between groups at each time were analyzed by the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests, adopting a level of significance of 5% (p < 0.05). The results showed that an energy density of 1.0 J/cm promoted an increase in cell proliferation at 48 and 72 h compared to the control and 0.5 J/cm groups. Cell cycle analysis revealed a predominance of cells in the S and G2/M phases in the irradiated groups. This finding was confirmed by the increased expression of Ki67. Low positive staining for annexin V and PI was observed in all groups, and no nuclear changes were detected, indicating that cell viability was not affected by the energy densities tested. It can be concluded that the LLLI parameters used (660 nm, 30 mW, 1.0 J/cm) promote the proliferation of SHEDs and the maintenance of cell viability.