クロマチンテンプレートからの転写開始部位の特定における二価カチオンの役割（in vitro

A role for divalent cations in specifying the start site for transcription from chromatin templates in vitro.

• Z Y Zhang-Keck
• F Eckstein
• L D Washington
• M R Stallcup

抄録

ヌクレオシド5'-O-(2-チオ三リン酸塩)を用いたアッセイを用いて、安定に統合されたプロウイルスを含む培養ラット肝腫細胞からの単離核調製物中のマウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)RNA鎖の開始を検出した。アデノシン5'-O-(2-チオ三リン酸)、グアノシン5'-O-(2-チオ三リン酸)、またはウリジン5'-O-(2-チオ三リン酸)で開始されたRNA鎖を水銀-セファロースカラムクロマトグラフィーで残りのRNAから分離し、T1ヌクレアーゼ保護アッセイで正しく開始されたRNA鎖を分析した。チオヌクレオチド転写反応とT1ヌクレアーゼアッセイを併用することで、転写開始部位の正確な局在化が可能となった。MMTV RNA鎖の大部分は、長い末端リピートの右端と一致するPvuII部位から133ヌクレオチド上流の鋳型部位において、グアニシン5'-O-(2-チオ三リン酸)で開始された。しかし、いくつかのRNA鎖はまた、一次グアノシン開始部位の3ヌクレオチド以内のテンプレート部位でアデノシン5'-O-(2-チオ三リン酸)およびウリジン5'-O-(2-チオ三リン酸)で開始された。Mn2+をMg2+で置換した場合、MMTV RNA鎖はほぼ同じ効率で開始されたが、開始部位は生理的な開始部位から約40ヌクレオチド下流の位置にシフトした；Mn2+の存在下では、MMTV RNA鎖はグアノシン5'-O-(2-チオ三リン酸)のみで開始された。核をMn2+とMg2+の両方に曝露すると、転写はマンガン依存性の部位で開始した。また、Mn2+は45 S pre-rRNAの転写開始部位を生理的に正しい開始部位から約10ヌクレオチド上流にシフトさせた。

An assay that employs nucleoside 5'-O-(2-thiotriphosphates) was used to detect initiation of mouse mammary tumor virus (MMTV) RNA chains in preparations of isolated nuclei from cultured rat hepatoma cells containing stably integrated proviruses. RNA chains initiated with adenosine 5'-O-(2-thiotriphosphate), guanosine 5'-O-(2-thiotriphosphate), or uridine 5'-O-(2-thiotriphosphate) were separated from the remaining RNA by mercury-Sepharose column chromatography and analyzed for correctly initiated RNA chains with a T1 nuclease protection assay. Combined use of the thionucleotide transcription reaction with the T1 nuclease assay allowed precise localization of the transcription start sites. The majority of MMTV RNA chains were initiated with guanosine 5'-O-(2-thiotriphosphate) at a template site 133 nucleotides upstream from a PvuII site that coincides with the right end of the long terminal repeat. However, some RNA chains were also initiated with adenosine 5'-O-(2-thiotriphosphate) and uridine 5'-O-(2-thiotriphosphate) at template sites within three nucleotides of the primary guanosine start site. When Mn2+ was substituted for Mg2+ in the transcription reaction, MMTV RNA chains were initiated with approximately the same efficiency, but the start site was shifted to a position approximately 40 nucleotides downstream from the physiological start site; in the presence of Mn2+, MMTV RNA chains were initiated only with guanosine 5'-O-(2-thiotriphosphate). When the nuclei were exposed to both Mn2+ and Mg2+, transcription initiated at the manganese-dependent site. Mn2+ also caused the transcription start site for 45 S pre-rRNA to shift about 10 nucleotides upstream from the physiologically correct start site.