幅広い腸内細菌に有効なプラスミド-トランスポゾンハイブリッド変異誘発システム

A Plasmid-Transposon Hybrid Mutagenesis System Effective in a Broad Range of Enterobacteria.

• Rita Monson
• Debra S Smith
• Miguel A Matilla
• Kevin Roberts
• Elizabeth Richardson
• Alison Drew
• Neil Williamson
• Josh Ramsay
• Martin Welch
• George P C Salmond

抄録

ランダムトランスポゾン突然変異誘発は、多くの異なる細菌株で遺伝子挿入のライブラリを生成するために使用される強力な技術です。ここでは、Pectobacterium atrosepticum、Citrobacter rodentium、Serratia sp. ATCC39006、Serratia plymuthica、Dickeya dadantii、および多くの異なるグラム陰性細菌株の範囲でランダムトランスポゾン突然変異誘発を容易にするシステムを開発しています。これらの菌株に対してトランスポゾン突然変異誘発法を最適化し、その有効性を示すために3つの研究を発表した。まず、重要な農業病原体であるD. dadantiiの変異誘発を行った。その結果、プロテアーゼの産生が低下した2つの変異体と、従来は不明瞭な色素であったインディゴイジンを産生する1つの変異体を同定し、その特徴を明らかにした。次に、腸内細菌Serratia sp. ATCC39006を突然変異させ、細胞内小器官であるプロテイナーゼであるガス小胞を産生できない変異体を同定した。そのうちの1つは、ガス小胞産生に必須の遺伝子gvpA1内にβ-ガラクトシダーゼ転写融合体を含んでいた。最後に、このシステムを用いて、植物性腸内細菌Dickeya solani MK10の抗真菌、抗真菌、抗癌ポリケチドであるオシジンAの生合成遺伝子クラスターを突然変異させた。突然変異誘発システムは、トランスポゾンと隣接するDNAを含むレプリコンを簡単に生成した後、切除後のシークエンシングによりトランスポゾン挿入部位を容易に同定できるように開発されました。さらに、β-ガラクトシダーゼやβ-グルクロニダーゼをレポーターとした転写融合体の作製が可能であり、また、様々な薬剤耐性マーカーを利用することで、1つの株に複数の選択可能な融合体を作製することが可能である。様々なトランスポゾンのこのシステムは、幅広い有用性を有し、多くの異なる方法で組み合わせることができる。

Random transposon mutagenesis is a powerful technique used to generate libraries of genetic insertions in many different bacterial strains. Here we develop a system facilitating random transposon mutagenesis in a range of different Gram-negative bacterial strains, including Pectobacterium atrosepticum, Citrobacter rodentium, Serratia sp. ATCC39006, Serratia plymuthica, Dickeya dadantii, and many more. Transposon mutagenesis was optimized in each of these strains and three studies are presented to show the efficacy of this system. Firstly, the important agricultural pathogen D. dadantii was mutagenized. Two mutants that showed reduced protease production and one mutant producing the previously cryptic pigment, indigoidine, were identified and characterized. Secondly, the enterobacterium, Serratia sp. ATCC39006 was mutagenized and mutants incapable of producing gas vesicles, proteinaceous intracellular organelles, were identified. One of these contained a β-galactosidase transcriptional fusion within the gene gvpA1, essential for gas vesicle production. Finally, the system was used to mutate the biosynthetic gene clusters of the antifungal, anti-oomycete and anticancer polyketide, oocydin A, in the plant-associated enterobacterium, Dickeya solani MK10. The mutagenesis system was developed to allow easy identification of transposon insertion sites by sequencing, after facile generation of a replicon encompassing the transposon and adjacent DNA, post-excision. Furthermore, the system can also create transcriptional fusions with either β-galactosidase or β-glucuronidase as reporters, and exploits a variety of drug resistance markers so that multiple selectable fusions can be generated in a single strain. This system of various transposons has wide utility and can be combined in many different ways.