三次元培養系における軟骨細胞による軟骨分解のin vitroモデル

An in vitro model of cartilage degradation by chondrocytes in a three-dimensional culture system.

• Katsuhito Nakashima
• Kensuke Nakatsuka
• Kyoko Yamashita
• Kurita Kenichi
• Hayakawa Taro

抄録

目的:

軟骨細胞のin vitro試験に有利とされるアルジネートビーズ三次元培養法を用いて、IL-1β誘導軟骨破壊に対するTGF-βの阻害効果に関する先行報告を確認し、軟骨破壊におけるプロテイナーゼとその阻害剤の変化を連続的に評価した。

OBJECTIVE: Using the alginate bead three-dimensional culturing method, which is considered to be advantageous for the in vitro study of chondrocytes, we confirmed earlier reports concerning the inhibitory effect of TGF-β on IL-1β-induced cartilage destruction and serially evaluated changes in proteinases and their inhibitors in cartilage destruction.

方法:

軟骨細胞は、IL-1βまたはTGF-β単独またはその両方でアルギン酸ビーズ上で培養した。培地中のグリコサミノグリカン（GAG）濃度はDMMBアッセイを用いて決定し、TIMP-1、-2およびproMMP-3のレベルはそれぞれのサンドイッチEIAを用いて測定した。ビーズの切片を調製し、トルイジンブルーまたは抗TIMP-1-2, -3抗体で染色した。細胞周囲プロテオグリカン染色陰性の軟骨細胞数およびＴＩＭＰ陽性の軟骨細胞数を数え、細胞外マトリックス中のＴＩＭＰ-３の陽性染色を調べた。TIMP-1、-2、-3、および MMP-3 の遺伝子発現を RT-PCR で評価した。

METHODS: Chondrocytes were cultured on alginate beads with IL-1β or TGF-β alone or both. The glycosaminoglycan (GAG) concentration in the culture medium was determined by use of the DMMB assay; and the levels of TIMP-1, -2 and proMMP-3 were measured with their respective sandwich EIAs. Sections of the beads were prepared and stained with toluidine blue or anti-TIMP-1 -2, -3 antibodies. The numbers of chondrocytes negative for pericellular proteoglycan staining and TIMP-positive chondrocytes were counted, and positive staining for TIMP-3 in the extracellular matrix was examined. RT-PCR was performed to evaluate the gene expression of TIMP-1, -2, -3, and MMP-3.

結果:

TIMP-1(+)軟骨細胞数、培養液中のTIMP-1濃度、TIMP-1遺伝子発現は、いずれもIL-1β刺激後6時間で最大に増加し、その後徐々に減少した。しかし、TIMP-3の免疫陽性細胞数は、やや後に増加した。培養液中のGAGおよびproMMP-3濃度は時間とともに徐々に増加した。TGF-β群では、IL-1β群の値と比較して、TIMP-3(+)軟骨細胞数および細胞外マトリックス中のTIMP-3陽性染色が有意に増加した。また、TGF-β処理細胞の培養液中のproMMP-3濃度は、IL-1β処理細胞のそれと比較して、全ての時間において有意に低下した。

RESULTS: The number of TIMP-1(+)chondrocytes, TIMP-1 concentration in the culture medium, and TIMP-1-gene expression all increased maximally as early as 6 hours after IL-1β stimulation, and then gradually decreased. However, the number of cells immunopositive for TIMP-3 increased somewhat later. GAG and proMMP-3 concentrations in the culture medium increased gradually with time. The number of TIMP-3(+)chondrocytes and positive staining for TIMP-3 in the extracellular matrix significantly increased in the TGF-β group compared with the values for the IL-1β group. The proMMP-3 concentration in the culture medium of TGF-β-treated cells was significantly decreased compared with that for the IL-1β-treated ones at all times examined.

DISCUSSION:

私たちは、関節軟骨破壊の初期段階ではTIMP-1が関節軟骨破壊の予防に主要な役割を果たしていますが、TIMP-3が徐々にその役割を引き継いでいることを示唆しています。また、TGF-βはこれらのTIMP-1を制御し、関節軟骨破壊の抑制因子として作用することが示された。これらの結果から、TIMP-1とTIMP-3は、OAなどの関節障害の進行防止に密接に関与していることが示唆されました。

DISCUSSION: We suggest that TIMP-1 plays a primary role in the prevention of articular cartilage destruction in its early stage but that TIMP-3 gradually takes over this role. Also, TGF-β was shown to regulate these TIMPs and act as a suppressor of articular cartilage destruction. These results suggest that TIMP-1 and TIMP-3 are closely involved in preventing the progression of joint disorders such as OA.