酪酸はヒト歯肉線維芽細胞において活性酸素の産生を誘導し、細胞周期の進行に影響を与える

Butyrate induces reactive oxygen species production and affects cell cycle progression in human gingival fibroblasts.

抄録

背景と目的:

酪酸やプロピオン酸などの短鎖脂肪酸は，Porphyromonas gingivalisなどの歯周病微生物叢が生成する代謝副産物であり，歯周炎の病態形成に寄与する。しかし，酪酸が歯肉線維芽細胞（GF）の生物学的活性に及ぼす影響については，十分に解明されていない。

BACKGROUND AND OBJECTIVE: Short-chain fatty acids, such as butyric acid and propionic acid, are metabolic by-products generated by periodontal microflora such as Porphyromonas gingivalis, and contribute to the pathogenesis of periodontitis. However, the effects of butyrate on the biological activities of gingival fibroblasts (GFs) are not well elucidated.

材料と方法:

ヒトGFを様々な濃度の酪酸（0.5-16 mm）に24時間曝露した。トリパンブルーを排除した生存細胞を計数した。GFの細胞周期分布をヨウ化プロピジウム染色フローサイトメトリーで解析した。細胞の活性酸素種（ROS）産生量は，2',7'-ジクロロフルオレセイン（DCF）を用いたフローサイトメトリーで測定した。トータルRNAおよびタンパク質ライセートを分離し，それぞれ特異的プライマーを用いたRT-PCRおよび特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。

MATERIAL AND METHODS: Human GFs were exposed to various concentrations of butyrate (0.5-16 mm) for 24 h. Viable cells that excluded trypan blue were counted. Cell cycle distribution of GFs was analyzed by propidium iodide-staining flow cytometry. Cellular reactive oxygen species (ROS) production was measured by flow cytometry using 2',7'-dichlorofluorescein (DCF). Total RNA and protein lysates were isolated and subjected to RT-PCR using specific primers or to western blotting using specific antibodies, respectively.

結果:

酪酸はGFの増殖を阻害し，生存細胞数の減少を示した。この現象は、酪酸（4-16 mm）によるGFのG0/G1およびG2/M細胞周期停止の誘導と関連していた。しかし、この実験条件では、GFの顕著なアポトーシスは認められなかった。酪酸（2 mm以上）は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングを用いて、GFにおけるcdc2、cdc25CおよびcyclinB1のmRNAの発現を阻害し、Cdc2、Cdc25CおよびcyclinB1タンパク質のレベルをそれぞれ低下させた。酪酸のこの毒性作用は、活性酸素の生成と関連していた。

RESULTS: Butyrate inhibited the growth of GFs, as indicated by a decrease in the number of viable cells. This event was associated with an induction of G0/G1 and G2/M cell cycle arrest by butyrate (4-16 mm) in GFs. However, no marked apoptosis of GFs was noted in this experimental condition. Butyrate (> 2 mm) inhibited the expression of cdc2, cdc25C and cyclinB1 mRNAs and reduced the levels of Cdc2, Cdc25C and cyclinB1 proteins in GFs, as determined using RT-PCR and western blotting, respectively. This toxic effect of butyrate was associated with the production of ROS.

おわりに:

これらの結果から，歯周病菌が生成する酪酸は，活性酸素の産生を誘導し，GFの細胞増殖，細胞周期の進行，細胞周期関連遺伝子の発現を阻害することで，歯周病の発症に関与している可能性が示唆された。これらの事象は、歯周病の炎症プロセスの開始および長期化に重要である。

CONCLUSION: These results suggest that butyrate generated by periodontal pathogens may be involved in the pathogenesis of periodontal diseases via the induction of ROS production and the impairment of cell growth, cell cycle progression and expression of cell cycle-related genes in GFs. These events are important in the initiation and prolongation of inflammatory processes in periodontal diseases.