サブチラーゼサイトトキシンは、C/EBF-homologue protein (CHOP)、Ire1α、JNK シグナルとは無関係に、Bax/Bak の活性化を介してミトコンドリアの透過性を誘導し、HeLa 細胞のアポトーシスを誘導した

Subtilase cytotoxin induces apoptosis in HeLa cells by mitochondrial permeabilization via activation of Bax/Bak, independent of C/EBF-homologue protein (CHOP), Ire1alpha or JNK signaling.

• Kinnosuke Yahiro
• Naoko Morinaga
• Joel Moss
• Masatoshi Noda

抄録

Subtilase cytotoxin（SubAB）は、滋賀毒性大腸菌の一部の株で産生されるAB(5)サイトトキシンである。Aサブユニットは、サブチラーゼ様セリンプロテアーゼであり、小胞体シャペロンであるBiPを切断し、一過性のタンパク質合成阻害とG(1)期の細胞周期停止を引き起こし、Vero細胞ではミトコンドリア膜損傷を介してカスパーゼ依存性のアポトーシスを誘導することが知られている。ここでは、HeLa細胞におけるミトコンドリア膜透過のメカニズムを調べた。シクロスポリンAはチトクロムcの放出を抑制しなかったため、SubABによるサイトゾルへのチトクロムc放出はミトコンドリア透過性遷移孔(PTP)に依存しなかった。SubABは抗アポトーシスBcl-2やBcl-XL、プロアポトーシスBaxやBakの発現を変化させなかったが、BaxやBakのコンフォメーション変化やBaxとBakの結合を誘発した。baxおよびbakの両方の遺伝子のsiRNAを用いたサイレンシングは、bax、bak、またはbim単独ではなく、チトクロームc放出、カスパーゼ-3活性化、DNAラダー形成および細胞毒性の減少をもたらし、BaxおよびBakがアポトーシスに関与していることを示した。SubABはER膜貫通トランスデューサー、Ire1α、cJun N末端キナーゼ（JNK）を活性化し、C/EBF-homologue protein（CHOP）を誘導した。これらのシグナルがBax活性化によるシトクロムc放出に関与しているかどうかを調べるために、IRE1ALPHA、JNK、CHOPをサイレンシングしたが、サイレンシングはSubAB誘導性シトクロムc放出を減少させなかった。

Subtilase cytotoxin (SubAB) is an AB(5) cytotoxin produced by some strains of Shiga-toxigenic Escherichia coli. The A subunit is a subtilase-like serine protease and cleaves an endoplasmic reticulum (ER) chaperone, BiP, leading to transient inhibition of protein synthesis and cell cycle arrest at G(1) phase, and inducing caspase-dependent apoptosis via mitochondrial membrane damage in Vero cells. Here we investigated the mechanism of mitochondrial permeabilization in HeLa cells. SubAB-induced cytochrome c release into cytosol did not depend on mitochondrial permeability transition pore (PTP), since cyclosporine A did not suppress cytochrome c release. SubAB did not change the expression of anti-apoptotic Bcl-2 or Bcl-XL and pro-apoptotic Bax or Bak, but triggered Bax and Bak conformational changes and association of Bax with Bak. Silencing using siRNA of both bax and bak genes, but not bax, bak, or bim alone, resulted in reduction of cytochrome c release, caspase-3 activation, DNA ladder formation and cytotoxicity, indicating that Bax and Bak were involved in apoptosis. SubAB activated ER transmembrane transducers, Ire1alpha, and cJun N-terminal kinase (JNK), and induced C/EBF-homologue protein (CHOP). To investigate whether these signals were involved in cytochrome c release by Bax activation, we silenced ire1alpha, jnk or chop; however, silencing did not decrease SubAB-induced cytochrome c release, suggesting that these signals were not necessary for SubAB-induced mitochondrial permeabilization by Bax activation.

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