t(14;18)転座陽性リンパ腫細胞株における偽陰性BCL2タンパク質発現：代替BCL2抗体の必要性

Pseudonegative BCL2 protein expression in a t(14;18) translocation positive lymphoma cell line: a need for an alternative BCL2 antibody.

• Noraidah Masir
• Lisa J Campbell
• Margaret Jones
• David Y Mason

抄録

エイム:

t(14;18)(q32;q21)染色体転座は、ほとんどの濾胞性リンパ腫においてBCL2タンパク質の発現を誘導する。しかし、t(14;18)(q32;q21)転座を有するにもかかわらず、BCL2の発現を欠く症例は少数である。本研究では、t(14;18)転座が存在する場合のBCL2タンパク質発現の欠如のメカニズムを探ることを目的としている。

AIM: The t(14;18)(q32;q21) chromosomal translocation induces BCL2 protein expression in most follicular lymphomas. However, a small number of cases lack BCL2 expression despite carrying the t(14;18)(q32;q21) translocation. This study aims to explore the mechanism accounting for the lack of BCL2 protein expression when the t(14;18) translocation is present.

方法:

t(14;18)陽性細胞株FL18、Karpas-422、SU-DHL-4およびSU-DHL-6におけるBCL2発現をウェスタンブロッティングおよび2つの異なる抗体を用いた免疫組織化学によって分析した。細胞株の細胞遺伝的変化を確認するためにFISH解析を行い、BCL2 mRNAレベルをリアルタイム定量PCRで評価した。転座BCL2の配列解析は、FL18、Karpas-422、SU-DHL-4およびSU-DHL-6細胞株について行った。

METHODS: BCL2 expression in the t(14;18) positive cell lines FL18, Karpas-422, SU-DHL-4 and SU-DHL-6, was analysed by Western blotting and by immunohistochemistry using two different antibodies. FISH analysis was performed to confirm the cytogenetic changes in the cell lines and real time quantitative PCR was used to evaluate the BCL2 mRNA level. Sequence analysis of translocated BCL2 was performed on FL18, Karpas-422, SU-DHL-4 and SU-DHL-6 cell lines.

結果:

FL18、Karpas-422、SU-DHL-4では、BCL2 mRNAレベルはBCL2タンパク質発現と相関していた。対照的に、SU-DHL-6株では、t(14;18)転座と高レベルのmRNAの存在にもかかわらず、標準的な抗BCL2抗体(BCL2/124)を用いてもBCL2タンパク質は検出されなかった。転座したBCL2のcDNA配列決定は、SU-DHL-6株で3つの変異を示し、そのうちの1つは標準的なBCL2抗体で認識される領域のアミノ酸置換(I48F)をもたらしたが、他の2つはaa71とaa72のサイレント変異であった。興味深いことに、BCL2の発現を代替抗体であるE17で検査したところ、SU-DHL-6でタンパク質が検出され、標準抗体を用いたBCL2に対するSU-DHL-6株の「陰性」は偽物であることが示唆された。アミノ酸の変化は、カルパス-422（G47D、P59L）とSU-DHL-4（P59T、S117R）で見られたが、これらはBCL2の検出に影響を与えなかった。

RESULTS: In FL18, Karpas-422, and SU-DHL-4, the BCL2 mRNA level correlated with the BCL2 protein expression. In contrast, BCL2 protein was not detected in SU-DHL-6 line using standard anti-BCL2 antibody (BCL2/124), despite the presence of the t(14;18) translocation and high level of mRNA. cDNA sequencing of translocated BCL2 showed three mutations in the SU-DHL-6 cell line, one of which resulted in an amino acid substitution (I48F) in the region recognised by the standard BCL2 antibody, whereas the other two were silent mutations at aa71 and aa72. Interestingly, when BCL2 expression was tested with an alternative antibody, E17, the protein was detected in SU-DHL-6, suggesting that the 'negativity' of SU-DHL-6 line for BCL2 using the standard antibody is spurious. Amino acid changes were found in Karpas-422 (G47D, P59L) and SU-DHL-4 (P59T, S117R) but these did not affect BCL2 detection.

結論:

この研究は、転座した BCL2 遺伝子のいくつかの体細胞変異が BCL2 抗体によるエピトープ認識を阻害し、標準抗体を用いた偽陰性発現を引き起こす可能性を示唆しています。実際には、偽陰性を防ぐために、すべての BCL2 陰性症例を日常的に代替抗体で染色することが推奨されます。

CONCLUSIONS: This study suggests that some somatic mutations of the translocated BCL2 gene may prevent epitope recognition by BCL2 antibodies, and hence cause false negative expression using the standard antibody. It is recommended that in practice all BCL2 negative cases should routinely be stained with an alternative antibody to prevent false negativity.