ヒト歯髄細胞における三酸化ミネラル凝集体誘導性ミネラリゼーションを制御するカルシウム感受性レセプターの同定

Identification of a Calcium-sensing Receptor in Human Dental Pulp Cells That Regulates Mineral Trioxide Aggregate-induced Mineralization.

抄録

はじめに:

本研究の目的は、ヒト歯髄細胞(hDPCs)におけるカルシウム感受性受容体(CaSR)の発現と、三酸化ミネラル凝集体(MTA)によって誘導される歯突起分化および無機化におけるその役割を確認することである。

INTRODUCTION: The purpose of this study was to verify the expression of the calcium-sensing receptor (CaSR) and its role in mineral trioxide aggregate (MTA)-induced odontoblastic differentiation and mineralization in human dental pulp cells (hDPCs).

方法:

ヒト歯髄組織およびhDPCにおけるCaSRの発現を、免疫組織化学的および免疫蛍光アッセイを用いて検出した。次に、規定濃度のMTA希釈液単独またはカルシメト リックR-568（CaSRの陽性アロステリックモジュレーター［Tocris Bioscience, Bristol, UK］）を添加した特定の培地でhDPCを培養し、細胞生存率をCell Counting Kit-8（Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan）分析によりモニターした。アルカリホスファターゼ活性、アリザリンレッドS染色、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ウェスタンブロットを用いて、希釈MTA、R-568、石灰化Calhex 231（CaSRの陰性アロステリックモジュレーター[Sigma-Aldrich, St Louis, MO]）の異なる組み合わせを添加した培地における歯牙芽細胞関連マーカーおよびCaSRの遺伝子／タンパク質発現を調べた。

METHODS: The expression of CaSR in human dental pulp tissue and hDPCs was detected using immunohistochemical and immunofluorescent assays. Then, hDPCs were cultured in specific medium supplemented with defined concentrations of MTA dilute alone or in combination with calcimimetic R-568 (a positive allosteric modulator of CaSR [Tocris Bioscience, Bristol, UK]), and cell viability was monitored by Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) analysis. Alkaline phosphatase activity, alizarin red S staining, quantitative real-time polymerase chain reaction, and Western blot were used to investigate the gene/protein expression of odontoblastic-associated markers and CaSR in medium supplemented with different combinations of diluted MTA, R-568, and calcilytic Calhex 231 (a negative allosteric modulator of CaSR [Sigma-Aldrich, St Louis, MO]).

結果:

CaSRは中心歯髄組織ではわずかに発現していたが、hDPCの歯牙芽細胞層、細胞膜、細胞質では強く発現していた。Cell Counting Kit-8アッセイにより、1:8希釈MTA添加剤で処理した培養細胞では、細胞生存率が最大であることが示された。未分化のコントロールと比較して、歯牙分化の初期段階にある細胞は、より低いCaSRタンパク質発現を示した。1:8希釈MTAと0.1μmol/Lおよび1.0μmol/LのR-568の併用は、細胞活力を有意に増加させたが、アルカリホスファターゼ活性および鉱化沈着物形成を低下させ、この負の効果は1.0μmol/LのCalhex 231の補充によって減弱させることができた。定量的ポリメラーゼ連鎖反応の結果、1μmol/L R-568で処理したhDPCでは、RUNX2、DSPP、DMP-1、OCN遺伝子の発現が有意に上昇した。ウェスタンブロット解析によると、MTAとR-568の単独あるいは併用処理では、CaSRと象牙質シアロホスホタンパク質のタンパク質レベルに明確な傾向は認められなかったが、Calhex 231はこれらの発現を増加させることが示された。さらに、R-568およびCalhex 231で処理したhDPCでは、Aktリン酸化の亢進が観察された。

RESULTS: CaSR was slightly expressed in the central pulp tissue, whereas it was strongly expressed in the odontoblast layer, plasma membrane, and cytoplasm of hDPCs. Cell Counting Kit-8 assay indicated maximum cell viability in cultures treated with 1:8 diluted MTA additives. Compared with undifferentiated controls, the cells at the early stage of odontoblastic differentiation exhibited lower CaSR protein expression. The combination of 1:8 diluted MTA with 0.1 and 1.0 μmol/L R-568 led to significantly increased cell vitality but decreased alkaline phosphatase activity and mineralized deposit formation, and this negative effect could be attenuated by 1.0 μmol/L Calhex 231 supplementation. Quantitative polymerase chain reaction results showed a significant up-regulation of RUNX2, DSPP, DMP-1, and OCN gene expression in the 1 μmol/L R-568-treated hDPCs. Western blot analysis indicated that the treatment by MTA and R-568 alone or their combination gave no clear trend on the protein levels of CaSR and dentin sialophosphoprotein, whereas Calhex 231 can increase their expressions. In addition, the up-regulation of Akt phosphorylation was observed in R-568- and Calhex 231-treated hDPCs.

結論:

CaSRはヒト歯髄およびhDPCsに発現しており、リガンド依存的にホスホイノシチド3-キナーゼ/Akt経路を介してMTA誘導hDPCsの石灰化をネガティブまたはポジティブに制御することが示され、修復象牙質形成を調節する治療標的であることが示唆された。

CONCLUSIONS: Our data indicated that CaSR is expressed in human dental pulp and hDPCs and that it can negatively or positively regulate MTA-induced mineralization of hDPCs via the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway in a ligand-dependent manner, suggesting a therapeutic target for modulating reparative dentin formation.