骨再生の新たなメカニズムが明らかに！！ / 松下 祐樹

【紹介論文】

A Wnt-mediated transformation of the bone marrow stromal cell identity orchestrates skeletal regeneration

Matsushita Y, Nagata M, Kozloff KM, Welch JD, Mizuhashi K, Tokavanich N, Hallett SA, Link DC, Nagasawa T, Ono W, Ono N.

Nat Commun. 2020 Jan 16;11(1):332

*Selected to one of the editors’ highlights in stem cells and disease

*Paper award 2020 in United Japanese researchers Around the world

日々の臨床で遭遇する骨再生

日常の歯科臨床で骨を再生させたいと感じる場面に遭遇する、または実際に骨の再生療法を行っている先生も多いだろう。

例えば歯周病による歯槽骨の喪失に対する再生療法、抜歯後の歯槽骨保存療法、インプラント治療に際しての退縮した顎堤や吸収した歯槽骨に対する骨造成術、嚢胞や腫瘍により吸収、破壊された顎骨の再建、顎骨骨折の治癒過程など、様々な歯科、口腔外科治療時に、骨の再生が必要になる。筆者自身、もともと口腔外科臨床医として抜歯窩の治癒や、骨折の治癒、顎骨の再建など、多くの場面で骨再生という事象に遭遇してきた（図１）。

^{図１　日常臨床で遭遇する、骨再生を考慮する場面}

一方で教科書を見ると、骨折などの骨再生過程では、まず始めに「間葉系幹細胞」が骨再生部位に集まり、骨再生を引き起こす、と当然のように書いてあるが、実は誰一人としてこの間葉系幹細胞を直接見たことがないのが現状である。これらのことから筆者は骨再生に興味を持ち、「骨再生過程における間葉系幹細胞を見つけ出し、骨再生のメカニズムを明らかにしたい！」と考え、現在ミシガン大学歯学部、Ono Lab（小野法明先生主宰）に所属して研究を行っている。そして今回、もともと骨の中に存在している骨髄間質細胞が間葉系幹細胞様の細胞に一旦逆戻りし、その後再生骨になるという、これまでの間葉系幹細胞で説明されていた概念とは異なる骨再生経路が存在することをマウスの大腿骨を用いた実験により明らかにしたので、紹介させていただく。

幹細胞 vs 細胞の可塑性 (Plasticity)

そもそも骨には場所に応じた様々な幹細胞が存在することが、近年、筆者の所属するOno Lab含め、いくつかのグループで明らかにされてきた[1-4]（図２）

^{図２　⻑管骨に存在する部位特異的な骨格幹細胞}

骨髄に存在する間葉系幹細胞は1960年代からその概念は提唱されているものの、実際には今も正確には同定されていない。しかしながら、候補となる細胞はこれまでにもいくつか報告されており、筆者らはその中でもCXCL12というケモカインを豊富に含む骨髄間質細胞（CXCL12陽性骨髄間質細胞）に着目し、図３に示すように、骨髄間質細胞が赤く光るマウス（Cxcl12-creER; tdTomatoマウス）を作出した。骨髄間質細胞は骨髄中に網の目のように存在しており、造血系細胞の機能をサポートすることが分かっている。

^{図３　CXCL12陽性骨髄間質細胞（赤色）の局在と骨に存在する細胞}

^{骨髄は主に造血系細胞、血管系細胞、骨格系細胞で形成されており（A）、骨髄間質細胞は骨格系細胞の一つとして、血管周囲に網の目のように存在し（B）、造血機能をサポートしている。}

このマウスのユニークなところはこの赤い細胞の系譜、分化の流れを追跡できるということである。もともと骨髄間質細胞は骨髄のみに存在しているため、骨髄の中のみに赤い細胞が存在し、周囲の骨は全く赤く光らないが、例えば骨折後にこの細胞が骨の細胞に分化するのであれば分化後の骨芽細胞や骨細胞も赤く光ることになる（図４）。

^{図４　Cxcl12-creER;tdTomatoマウスを利用した細胞系譜追跡}

^{定常状態では骨髄間質細胞のみが赤く光る（左図）。骨再生過程において、この赤い骨髄間質細胞が骨芽前駆細胞、骨芽細胞に直接分化した場合、これらの分化後の細胞も赤く光る（右図）。}

実際、今回の研究では大腿骨にドリルで損傷を加え、骨再生過程を観察したところ、非常に多くの赤い骨髄間質細胞が損傷部位に集まり、最終的に再生骨に分化することが明らかとなった（図５）。

^{図５ 骨再生モデルとCXCL12陽性骨髄間質細胞の系譜追跡（本論文より改変）}

^{Cxcl12-creER;tdTomatoで赤く標識された細胞は、骨再生時には強力に増殖し、再生骨の骨芽細胞、骨細胞へと分化する。損傷を加えていない既存骨には赤い細胞は全く存在しない。}

このため、CXCL12陽性骨髄間質細胞こそが探し求めていた間葉系幹細胞だと考え、この赤い骨髄間質細胞がどのように骨になるかを明らかにするために、赤い細胞を集めてひとつひとつの細胞の特性と分化の方向をシングルセルRNA解析の手法を用いて詳細に解析した。これまでのバルク（一括）解析では本来多様性のあるはずの細胞を無理やりひとつのものとしてまとめて解析していたが、近年のシングルセル解析技術の普及により、細胞ひとつひとつの発現遺伝子を解析できるようになり、より正確な情報を得ることができるようになった（図６）。

^{図６　バルク（一括）解析とシングルセル解析}

^{バルク解析では骨髄間質細胞、骨芽前駆細胞、骨芽細胞など、多様性のあるはずの細胞をまとめて解析するため、本来の性質が隠れてしまうことがある。シングルセル解析ではひとつひとつの細胞を個別に解析するため、多様な細胞のそれぞれの性質を明らかにすることができる。}

予想通り骨再生時には骨髄間質細胞が骨芽細胞へと分化することが確認されたが、驚くべきことに、骨髄間質細胞が直接骨芽細胞へ分化するのではなく、骨髄間質細胞は一旦幹細胞様の細胞（中間体細胞）を経由して骨芽細胞へと分化していた（図７）。

^{図７　シングルセルRNA解析（本論文より改変）}

^{ひとつの点がひとつの細胞を意味しており、前述の赤い細胞はとても多様性に富んでいることが分かる。ひとつひとつの細胞の様々な遺伝子の発現量をもとに性質の似ている細胞をクラスター化して2次元で表示している。さらに分化の方向性を解析したところ、骨髄間質細胞から幹細胞様の細胞を経由して骨芽細胞になっていることが明らかとなった。}

さらに骨再生時には骨髄間質細胞だけでなく、骨芽細胞などの複数の種類の細胞が同時多発的に骨再生に寄与することが明らかとなった。

これまでは骨折の治癒などの骨再生過程では、分化のヒエラルキーの頂点に位置する唯一絶対の存在である間葉系幹細胞が、一方向に分化して骨芽細胞になると考えられてきたが、今回の研究結果によって骨に存在する骨髄間質細胞などの分化し終わったはずの細胞が分化の流れに逆らって、幹細胞様の性質を獲得（細胞の可塑性：Plasticity）し、その後、骨芽細胞に改めて分化するという新たな骨再生メカニズムが存在することが示唆された（図８）。

^{図８　幹細胞による骨再生と細胞の可塑性による骨再生}

^{本研究によって、終末分化した骨髄間質細胞が分化の流れに逆らって幹細胞様の性質を獲得し、改めて骨再生に寄与することが示唆された。}

近年、肝臓の再生など、他臓器においても幹細胞による再生機構から細胞の可塑性による再生機構へとパラダイムシフトが起こっている。また、iPS細胞の登場により細胞は特殊な環境下においてはその性質を初期化し、万能細胞になることが分かっている。

実際の生体内ではそこまで劇的なことは起こらないにしても、骨折などの組織損傷のような、体にとっての緊急事態が起こった際には、多くの細胞が分化の流れに逆らってでも組織再生のために貢献するということはむしろホメオスタシスの維持という観点から考えると当然のことなのかもしれない。

今後の展開

現在臨床においても間葉系幹細胞を適用した再生医学はホットトピックの一つだが、今回の研究結果が将来的に再生医学の治療戦略の一助になることを願っている。今後の展開としては「果たして骨髄に間葉系幹細胞は本当に存在するのか？」をテーマの一つとして取り組んでいきたい。

筆者コメント

渡米して4年が経過し、待望のFirst authorの論文になりました。骨再生は臨床家としても研究者としても自分がずっと興味を持って取り組んできたテーマであり、今回の研究によって、骨再生のメカニズムについて新たな概念を提案できたと考えています。もともとは小野法明先生とともに「幹細胞を探す」ことを目的としてスタートした研究でしたが、今回のように、仮説を立て、それをいい意味で大きく裏切られるような結果を得られたことは、まさに研究をする醍醐味の一つだと感じました。とは言え、まだまだ分かっていないことは多く、引き続き骨の形成、再生における骨格幹細胞とその周辺について解明していきたいと思っています。

また、本論文は最初に投稿してから論文の受理まで1年半程度を要しました。その間、複数の雑誌でレビューに進んだ上でのリジェクトを繰り返したため、その都度追加実験を行い、結果的に厚みのある自信の持てる内容に仕上げることができたので査読者にはとても感謝しています。と、今では冷静に振り返ることができますが、その当時は非常に苦しく、この論文執筆を通して精神的にタフになれたと思います。自分にとってこの経験は今後の大きな糧となりそうです。最後に、ご指導いただいた小野法明先生をはじめ、サポートいただいた皆様にはこの場を借りて感謝申し上げます。

^{研究室のメンバー}

^{前列右から2人目：小野法明先生　後列右：著者}

^{毎日お世話になっている顕微鏡とソフトウェア}

関連文献

[1] K. Mizuhashi, W. Ono, Y. Matsushita, N. Sakagami, A. Takahashi, T.L. Saunders, T. Nagasawa, H.M. Kronenberg, N. Ono, Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells, Nature 563(7730) (2018) 254-258.

[2] S. Debnath, A.R. Yallowitz, J. McCormick, S. Lalani, T. Zhang, R. Xu, N. Li, Y. Liu, Y.S. Yang, M. Eiseman, J.H. Shim, M. Hameed, J.H. Healey, M.P. Bostrom, D.A. Landau, M.B. Greenblatt, Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation, Nature 562(7725) (2018) 133-139.

[3] P. Bianco, X. Cao, P.S. Frenette, J.J. Mao, P.G. Robey, P.J. Simmons, C.Y. Wang, The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine, Nat Med 19(1) (2013) 35-42.

[4] Y. Matsushita, W. Ono, N. Ono, Skeletal Stem Cells for Bone Development and Repair: Diversity Matters, Curr Osteoporos Rep  (2020).