マイコバクテリアにおける条件付きDnaBタンパク質のスプライシングは亜鉛によって可逆的に阻害される

Conditional DnaB Protein Splicing Is Reversibly Inhibited by Zinc in Mycobacteria.

• Daniel Woods
• Sweta Vangaveti
• Ikechukwu Egbanum
• Allison M Sweeney
• Zhong Li
• Valjean Bacot-Davis
• Danielle S LeSassier
• Matthew Stanger
• Gabrielle E Hardison
• Hongmin Li
• Marlene Belfort
• Christopher W Lennon

抄録

インテインは、翻訳後制御要素として、条件付きタンパク質スプライシング（CPS）により、環境の変化に応じてタンパク質の機能を調整することができる。インテインは、宿主タンパク質を遮断するサブドメインとして翻訳され、隣接する配列（エクステイン）と無傷で結合するようにスプライシングされる。複製ヘリカーゼの DnaB-intein1 (DnaBi1) を用いて、DnaBi1 のスプライシングとカナマイシン耐性を結びつけるアナマイシンタンパク質プライシングエポーター (KISR) を構築した。異種細胞での発現を用いて、様々なレベルのスプライシング依存性耐性（SDR）の表現型クラスを観察し、これらをカナマイシン耐性タンパク質（KanR）内のDnaBi1の挿入位置と関連させた。我々はここで、マイコバクテリアの病原性の間に重要な亜鉛が、DnaBのスプライシングを阻害することを示しています。95Åの結晶構造から、亜鉛がスプライシング反応を開始するシステインに結合してスプライシングを阻害することを明らかにした。これらの結果は、マイコバクテリアの DnaB タンパク質のスプライシング、ひいては DNA 複製が環境中の亜鉛に反応するというモデルの説得力のある支持を提供しています。インテインは原核生物の大部分に存在し、マイコバクテリアの複製ヘリカーゼDnaBを含む保存されたタンパク質内に局在している。インテインは、その広範なタンパク質工学への応用に加えて、それをコードする遺伝子の環境応答性の翻訳後調節因子として出現した。いくつかの研究では、条件付きタンパク質スプライシング（CPS）の説得力のある証拠が示されているが、インテインのネイティブホストでのスプライシングを調べることは困難であることが証明されている。今回、私たちは、インテインの活性をモニタリングできるスプライシング依存性センサーを用いて、亜鉛がマイコバクテリアのDnaBスプライシングを強力かつ可逆的に阻害することを、いくつかの方法を用いて実証しました。また、この研究は、非ネイティブタンパク質内のインテイン挿入部位の選択に関する知見を広げ、スプライシング依存性の宿主タンパク質の活性化と活性部位の近接性が相関していることを示している。さらに、亜鉛によるスプライシング制御がマイコバクテリオシドやCPSへの応用の可能性を示唆している。

Inteins, as posttranslational regulatory elements, can tune protein function to environmental changes by conditional protein splicing (CPS). Translated as subdomains interrupting host proteins, inteins splice to scarlessly join flanking sequences (exteins). We used DnaB-intein1 (DnaBi1) from a replicative helicase of to build a anamycin ntein plicing eporter (KISR) that links splicing of DnaBi1 to kanamycin resistance. Using expression in heterologous , we observed phenotypic classes of various levels of splicing-dependent resistance (SDR) and related these to the insertion position of DnaBi1 within the kanamycin resistance protein (KanR). The KanR-DnaBi1 construct demonstrating the most stringent SDR was used to probe for CPS of DnaB in the native host environment, We show here that zinc, important during mycobacterial pathogenesis, inhibits DnaB splicing in Using an reporter system, we demonstrated that zinc potently and reversibly inhibited DnaBi1 splicing, as well as splicing of a comparable intein from Finally, in a 1.95 Å crystal structure, we show that zinc inhibits splicing through binding to the very cysteine that initiates the splicing reaction. Together, our results provide compelling support for a model whereby mycobacterial DnaB protein splicing, and thus DNA replication, is responsive to environmental zinc. Inteins are present in a large fraction of prokaryotes and localize within conserved proteins, including the mycobacterial replicative helicase DnaB. In addition to their extensive protein engineering applications, inteins have emerged as environmentally responsive posttranslational regulators of the genes that encode them. While several studies have shown compelling evidence of conditional protein splicing (CPS), examination of splicing in the native host of the intein has proven to be challenging. Here, we demonstrated through a number of measures, including the use of a splicing-dependent sensor capable of monitoring intein activity in the native host, that zinc is a potent and reversible inhibitor of mycobacterial DnaB splicing. This work also expands our knowledge of site selection for intein insertion within nonnative proteins, demonstrating that splicing-dependent host protein activation correlates with proximity to the active site. Additionally, we surmise that splicing regulation by zinc has mycobacteriocidal and CPS application potential.

Copyright © 2020 Woods et al.