エクソヌクレアーゼIII型自走式DNA装置を用いた核酸・タンパク質の増幅検出法の開発

Exonuclease III-Powered Self-Propelled DNA Machine for Distinctly Amplified Detection of Nucleic Acid and Protein.

• Shuang Liu
• Xiaoxiao Yu
• Jialong Wang
• Dengren Liu
• Li Wang
• Shufeng Liu

抄録

ここでは、核酸および核酸関連分析物のカスケード多段階シグナル増幅のために、エクソヌクレアーゼIII（Exo III）を動力源とする自走式DNA装置を開発した。この装置は、認識・増幅・シグナル伝達要素として一体型DNAハイブリッドプローブを用い、駆動力としてExo III切断を用いることで、簡単かつ均質に操作することが可能である。DNAハイブリッドプローブは、2本のヘアピン状DNAをアニーリングして得た。このDNAハイブリッドプローブの3'突出ドメインによる標的認識は、Exo III開裂の引き金となり、標的のリサイクルと大量の標的置換体とアナロジーの交互生成を伴った。同時に、生成された標的置換体とアナロジーによるDNAハイブリッドプローブへのカスケード双方向のExo III開裂が、標的認識イベントに向けて指数関数的に信号を増幅させることに貢献した。また、ヘアピン状のアプタマースイッチを追加することで、トロンビンを例にしたタンパク質検出への応用も可能である。提案したExo IIIを用いた自走式DNA増幅法は、標的DNAに対しては0.5 fMから1 pMまで、トロンビンに対しては5 fMから10 pMまでの直線的な検出範囲を示した。また、標的DNAの検出下限は0.1 fM程度、トロンビンの検出下限は5 fM程度であり、他の多くの手法と比較しても優れていることがわかった。また、標的検出に対しても優れた選択性を示した。以上のことから、開発したセンシングシステムは、核酸および核酸関連分析物の増幅検出のための新たな簡便かつ強力な手段であり、バイオ分析、疾患診断、バイオメディシンの分野で大きな可能性を秘めていると考えられます。

Herein, a new exonuclease III (Exo III)-powered self-propelled DNA machine was developed for the cascade multilevel signal amplification of nucleic acid and nucleic acid-related analytes. It could be easily and homogeneously operated with the use of an integral DNA hybrid probe as the recognition, amplification, and signaling element, and the Exo III cleavage as a driving force. The DNA hybrid probe was obtained by annealing two hairpin-like DNAs. The target recognition with the 3'-protruding domain of the DNA hybrid probe triggered Exo III cleavage, accompanied by target recycling and alternate generation of a large amount of target substitute and analogy. Simultaneously, the cascade bidirectional Exo III cleavage toward the DNA hybrid probe by the generated target substitute and analogy contributed for the exponential signal amplification toward target recognition event. It could be also extended for the application in protein detection with the thrombin as a protein example by introducing an additional hairpin-like aptamer switch. The proposed Exo III-powered self-propelled DNA amplification strategy showed a linear detection range for target DNA from 0.5 fM to 1 pM and for thrombin from 5 fM to 10 pM. The low detection limit toward target DNA and thrombin could reach about 0.1 fM and 5 fM, respectively, which were superior to most of reported methods. It also exhibited an excellent selectivity toward target detection. Therefore, the developed sensing system exhibits a new, simple and powerful means for amplified detection of nucleic acid and nucleic acid-related analytes, and may hold great potentials in bioanalysis, disease diagnosis and biomedicine.