ラット三叉神経節ニューロンの電気的活動の間接的な指標としてのGCaMP

GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.

• Jane E Hartung
• Michael S Gold

抄録

体性感覚情報が標識線、集団コーディング、周波数コーディング、あるいはそれらの組み合わせによって伝達されるのかどうかについては議論が続いているが、研究者たちは、数百から数千のニューロンの神経活動を同時に評価できる光学的アプローチを使用して、一次求心性のレベルでこの問題に取り組み始めている。しかし、大規模なニューロンの集団における電気的活動を光学的に評価するツールが限られているため、研究者は、ニューロン活動の相関関係として細胞質Ca濃度の上昇を検出することを可能にするために、GCaMPを含む遺伝的にコードされたCa指標（GECI）に注目してきた。最も広く使用されているGECIの一つは、感度（GCaMP6s）、速度（GCaMP6f）、または2つのバランス（GCaMP6m）のために調整された3つの異なるバージョンで利用可能なGCaMP6である。これらの問題が GCaMP6 自体に固有のものであるか、あるいは複数の世代の GCaMP に固有のものであるかを決定するために、我々は jGCaMP7 も特徴付けた。本研究では、0.1-30Hzの周波数範囲での一次求心性神経における活動の変化を検出するために、3つのGCaMP6アイソフォームの有用性を決定しようとした。感覚ニューロンの不均一性を考慮して、我々はまた、想定される侵害受容性求心性を識別するために使用される特性によって定義されるニューロンのサブ集団における各GCaMP6アイソフォームの性能を比較した：細胞の大きさ、イソレクチンB4（IB4）結合、およびカプサイシン感受性。最後に、GCaMP6を用いて得られた結果と、次世代のGCaMPであるjGCaMP7sおよびjGCaMP7fを発現するニューロンから得られた結果を比較した。急性解離ラット三叉神経節（TG）ニューロンにおけるGECI発現を駆動するために、AAV9-CAG-GCaMP6s/m/fを用いたウイルスアプローチを用い、神経活動を電場刺激によって駆動した。AAV血清型による感染効率は95％以上と高く、試験期間中（10日未満）のTGニューロンにおけるGCaMP6発現がfura-2を用いて評価した細胞内Caの調節に与える影響は最小限であった。フィールド刺激によって誘発されたCa過渡現象は、活動電位と電圧依存性Caチャネルの活性化によるCa流入に依存していることを確認し、また、各アイソフォームのS/N比が優れており、90%以上のニューロンで単一のスパイクを検出できることを確認した。しかし、GCaMP6アイソフォームの有用性は、各ニューロンの発火周波数の変化だけでなく、発火周波数の評価を可能にするものではなく、アイソフォームに依存したものであった。GCaMP6sと6mの分解能は最も低く、3Hzのスパイクを検出できたのはそれぞれ15％と32％のニューロンでしたが、GCaMP6fの36％のニューロンでは10Hzまでの単一スパイクを検出することができました。残念ながら、過渡現象の大きさや上昇速度などのCa過渡現象の他のパラメータを使用しても、スパイク数や発火頻度の変化を評価するためにこれらの指標を使用できる範囲を改善することはできませんでした。さらに、進行中の神経活動の存在下では、発火周波数の変化を検出することはさらに困難であった。Caの増加に対する周波数応答関係は、感覚ニューロン間で非常に不均一であり、それを評価するために使用されるGCaMP6アイソフォーム、刺激列車の配信間のタイミング（バースト間の間隔）、および求心性のサブポピュレーションの両方に影響を受けていた。特筆すべきことは、活動の程度の分解において、GCaMP6アイソフォームの場合と同様の欠陥がjGCaMP7sと7fで観察されたことである。これらのデータは、GCaMP6とjGCaMP7の両方が神経活動の有無を判断するために感覚ニューロンにおいて有用なツールとなる可能性がある一方で、発火周波数≧3 Hzの変化を識別する能力は非常に限られていることを示唆しています。その結果、GECIは、ニューロンの亜集団内または亜集団間での活動の変化を評価するために、感覚ニューロンにおいて使用すべきではないでしょう。

While debate continues over whether somatosensory information is transmitted via labeled line, population coding, frequency coding, or some combination therein, researchers have begun to address this question at the level of the primary afferent by using optical approaches that enable the assessment of neural activity in hundreds to even thousands of neurons simultaneously. However, with limited availability of tools to optically assess electrical activity in large populations of neurons, researchers have turned to genetically encoded Ca indicators (GECIs) including GCaMP to enable the detection of increases in cytosolic Ca concentrations as a correlate for neuronal activity. One of the most widely used GECIs is GCaMP6, which is available in three different versions tuned for sensitivity (GCaMP6s), speed (GCaMP6f), or a balance of the two (GCaMP6m). In order to determine if these issues were unique to GCaMP6 itself, or if they were inherent to more than one generation of GCaMP, we also characterized jGCaMP7. In the present study, we sought to determine the utility of the three GCaMP6 isoforms to detect changes in activity in primary afferents at frequencies ranging from 0.1-30 Hz. Given the heterogeneity of sensory neurons, we also compared the performance of each GCaMP6 isoform in subpopulations of neurons defined by properties used to identify putative nociceptive afferents: cell body size, isolectin B4 (IB4) binding, and capsaicin sensitivity. Finally, we compared results generated with GCaMP6 with that generated from neurons expressing the next generation of GCaMP, jGCaMP7s and jGCaMP7f. A viral approach, with AAV9-CAG-GCaMP6s/m/f, was used to drive GECI expression in acutely dissociated rat trigeminal ganglion (TG) neurons, and neural activity was driven by electrical field stimulation. Infection efficiency with the AAV serotype was high >95 %, and the impact of GCaMP6 expression in TG neurons over the period of study (<10 days) on the regulation of intracellular Ca, as assessed with fura-2, was minimal. Having confirmed that the field stimulation evoked Ca transients were dependent on Ca influx secondary to the activation of action potentials and voltage-gated Ca channels, we also confirmed that the signal-to-noise ratio for each of the isoforms was excellent, enabling detection of a single spike in>90% of neurons. However, the utility of the GCaMP6 isoforms to enable an assessment of the firing frequency let alone changes in firing frequency of each neuron was relatively limited and isoform specific: GCaMP6s and 6m had the lowest resolution, enabling detection of spikes at 3 Hz in 15% and 32% of neurons respectively, but it was possible to resolve discrete single spikes up to 10 Hz in 36% of GCaMP6f neurons. Unfortunately, using other parameters of the Ca transient, such as magnitude of the transient or the rate of rise, did not improve the range over which these indicators could be used to assess changes in spike number or firing frequency. Furthermore, in the presence of ongoing neural activity, it was even more difficult to detect a change in firing frequency. The frequency response relationship for the increase in Ca was highly heterogeneous among sensory neurons and was influenced by both the GCaMP6 isoform used to assess it, the timing between the delivery of stimulation trains (inter-burst interval), and afferent subpopulation. Notably, the same deficiencies were observed with jGCaMP7s and 7f in resolving the degree of activity as were present for the GCaMP6 isoforms. Together, these data suggest that while both GCaMP6 and jGCaMP7 are potentially useful tools in sensory neurons to determine the presence or absence of neural activity, the ability to discriminate changes in firing frequency ≥ 3 Hz is extremely limited. As a result, GECIs should probably not be used in sensory neurons to assess changes in activity within or between subpopulations of neurons.

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