糖タンパク質340のSRCRドメインのクローニング、発現および精製

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Protein Expr. Purif..2013 Aug;90(2):67-73. S1046-5928(13)00089-2. doi: 10.1016/j.pep.2013.05.003.Epub 2013-05-22.

糖タンパク質340のSRCRドメインのクローニング、発現および精製

Cloning, expression and purification of the SRCR domains of glycoprotein 340.

Sangeetha Purushotham
Champion Deivanayagam

PMID: 23707657 PMCID: PMC3727412. DOI: 10.1016/j.pep.2013.05.003.

抄録

自然免疫分子である糖タンパク質340（gp340）は、ヒト口腔内の単層上皮および関連腺から光を発して分泌される。Ｇｐ３４０は、１４個のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン、２つのＣＵＢ（Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓＵｅｇｆＢｍｐ１）ドメイン、および１つのゾナペルーシダ（ＺＰ）ドメインを含む。口腔内連鎖球菌は、その表面タンパク質抗原I/II（AgI/II）を介して歯に固定化されたgp340に付着することが知られており、これは最終的にコロニー化および感染をもたらす病原性の重要な第一段階であると考えられている。gp340のドメインと経口ストレプトコッカスのAgI/IIドメインとの相互作用を解読するために、我々はヒトgp340の最初のSRCRドメイン(SRCR1)と最初の3つのタンデムSRCRドメイン(SRCR123)をショウジョウバエS2細胞で発現させることを試みた。ヒトコドンを用いた初期の試みでは最適な結果は得られなかったが、ショウジョウバエS2細胞での発現のためのコドン最適化と、誘導性/分泌性ショウジョウバエ発現システム（DES）pMT/BiP/V5-HisAベクターの使用により、SRCRドメインの発現が大幅に増強された。ここでは、gp340のSRCRドメインのクローニング、発現、精製に成功したことを報告する。発現されたSRCRの構造依存性gp340抗体による認識は、これらのドメインが適切に折り畳まれていることを示し、さらに表面プラズモン共鳴研究は、SRCRドメインがAgI/IIに機能的に付着していることを確認した。

Glycoprotein 340 (gp340), an innate immunity molecule is secreted luminally by monolayered epithelia and associated glands within the human oral cavity. Gp340 contains 14 scavenger receptor cysteine rich (SRCR) domains, two CUB (C1r/C1s Uegf Bmp1) domains and one zona pellucida (ZP) domain. Oral streptococci are known to adhere to the tooth immobilized gp340 via its surface protein Antigen I/II (AgI/II), which is considered to be the critical first step in pathogenesis that eventually results in colonization and infection. In order to decipher the interactions between gp340's domains and oral streptococcal AgI/II domains, we undertook to express human gp340's first SRCR domain (SRCR1) and the first three tandem SRCR domains (SRCR123) in Drosophila S2 cells. While our initial attempts with human codons did not produce optimal results, codon-optimization for expression in Drosophila S2 cells and usage of inducible/secretory Drosophila expression system (DES) pMT/BiP/V5-HisA vector greatly enhanced the expression of the SRCR domains. Here we report the successful cloning, expression, and purification of the SRCR domains of gp340. Recognition of expressed SRCRs by the conformational dependent gp340 antibody indicate that these domains are appropriately folded and furthermore, surface plasmon resonance studies confirmed functional adherence of the SRCR domains to AgI/II.